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Abstract: Introduzione
Da circa dieci anni presso il Dipartimento di Anatomia, Istologia e Medicina Legale dell’Università
di Firenze è attivo il laboratorio di biofotonica dell’Istituto Nazionale di Ottica del CNR, attrezzato
per effettuare misure con tecniche avanzate di microscopia su materiali biologici.
Ultimamente sono state messe a punto tecniche di FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging
Microscopy) e FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), con le quali si possono acquisire
immagini non solo di tipo morfologico, ma anche funzionale, di materiale biologico in coltura.
Una molecola fluorescente (donatore) che si trovi nello stato eccitato può, anziché emettere un
fotone, trasferire la sua energia di eccitazione ad un altro fluoroforo (accettore) che si trovi nelle sue
immediate vicinanze (1-10 nanometri). Questo processo di interazione si indica con il termine
FRET.
Sfruttando questo processo è quindi possibile rivelare se due molecole biologiche (opportunamente
marcate) interagiscono fra di loro. Tutto questo utilizzando una tecnica ottica che è intrinsecamente
a bassa risoluzione spaziale (≈ 500 nanometri).
La presenza di FRET può essere rivelata in due modi: misurando la fluorescenza alla lunghezza
d’onda di emissione dell’accettore (che in assenza di FRET è nulla) oppure, misurando la riduzione
della vita media dell’emissione del donatore.
Il tempo di vita media della fluorescenza è l’intervallo di tempo nel quale, in media, il fluoroforo
rimane nello stato eccitato. In presenza di FRET questo tempo diminuisce perché, oltre al normale
processo di diseccitazione tramite l’emissione di un fotone, è disponibile un’altra via (la FRET
appunto).
Se due molecole di interesse biologico vengono legate una ad un donatore ed una ad un accettore,
misurando la FRET (per esempio tramite la variazione di vita media del donatore) siamo in grado di
valutare se queste interagiscono (cioè se la loro distanza è dell’ordine di qualche nanometro).
La misura della vita media di fluorescenza è resa possibile tramite la tecnica FLIM. Con essa è
possibile ottenere delle “immagini” dove ad ogni pixel è associata una curva di decadimento della
fluorescenza. La FLIM è quindi una tecnica di microspettroscopia ottica molto potente perché
permette di ottenere immagini funzionali. Il tempo di vita è infatti molto sensibile al microambiente
in cui si trova la molecola biologica in esame.
Scopo di questa attività di ricerca è stata l’ottimizzazione di queste tecniche dal punto di vista
dell’efficienza e selettività di eccitazione e raccolta dell’emissione fluorescente, sia per una
eccitazione a due fotoni che a singolo fotone.

Attività svolta
Il contributo dell’Ente Cassa è stato utilizzato in massima parte per l’acquisto di un dispositivo: il
“Cavity Dumper” (APE GmbH, Berlin, Germany), che è un interruttore acustoottico da inserire
nella cavità dell’oscillatore LASER sopra citato.
Detto dispositivo serve a ridurre la frequenza di ripetizione del treno d’impulsi (da 1:20 a 1:5000)
aumentando al contempo la potenza di picco degli stessi.
Lo scopo è duplice:
1) Permettere, con la tecnica FLIM, la misura di curve di decadimento della fluorescenza su
intervalli di tempo più lunghi. La frequenza originale di ripetizione del Ti: Zaffiro MIRA
900F è infatti di 76 MHz, corrispondente ad un periodo di 13 ns. Curve di decadimento più
lente sono quindi, in tal caso, difficilmente misurabili.
2) L’incremento della potenza di picco degli impulsi aumenta l’efficienza della conversione
nonlineare sia nel caso di eccitazione diretta a due fotoni del campione sia nella generazione
di luce di Supercontinuo basata sull’utilizzo di fibre ottiche microstrutturate.
Ottimizzata così la linea di eccitazione a due fotoni, la seconda fase del progetto è dedicata
all’ottimizzazione della linea di eccitazione a singolo fotone, sia rendendo più efficiente il processo
di conversione nonlineare allo scopo di ottenere uno spettro più ampio ed una maggiore potenza
dell’emissione di supercontinuo, sia migliorando la fase successiva di selezione della lunghezza
d’onda.
Sono state infatti sperimentate fibre microstrutturate non commerciali realizzate da vari gruppi di
ricerca con cui collaboriamo e siamo riusciti ad ottenere radiazione di supercontinuo intorno a 300
nm nell’UV fino a circa 1300 nm nel NIR.
Per quanto riguarda la selezione della lunghezza d’onda per l’eccitazione a singolo fotone, sono
stati utilizzati sia filtri interferenziali, sia un monocromatore assiale realizzato in proprio.
Una piccola parte del finanziamento è stata utilizzata per l’acquisto di un bagno termostatico ad
immersione con pompa di circolazione (Falc Instruments s.r.l., Treviglio (BG)) per il mantenimento
in condizioni vitali del materiale biologico sotto osservazione.

Obiettivi raggiunti
Gli obiettivi prefissati sono stati raggiunti e sono ampiamente documentati nelle pubblicazioni
scientifiche in elenco.
Abbiamo realizzato un monocromatore con simmetria assiale utilizzando un elemento ottico non
commerciale caratterizzato da una forte aberrazione cromatica longitudinale. La radiazione di
supercontinuo a largo spettro all’uscita della fibra ottica microstrutturata viene raccolta e focalizzata
dal monocromatore sull’apertura della fibra ottica di ingresso alla testa di scansione confocale. La
selezione della lunghezza d’onda avviene spostando semplicemente l’elemento ottico in direzione
assiale.
Il complesso beta1 integrina /canale hERG1 è coinvolto nella proliferazione, motilità ed invasività
delle cellule tumorali. La sua caratterizzazione molecolare è quindi particolarmente rilevante.
Con tecniche di FLIM-FRET, usando le proteine fluorescenti YFP-integrina e la CFP-hERG1 come
coppia di fluorocromi accettore /donore, si è dimostrato che queste interagiscono direttamente a
formare un complesso sulla membrana plasmatica di cellule HEK.
La Cx43 (Connessina43) e Cdo (CAM-related/down regulated by oncogenes) sono due proteine
coinvolte nel processo di miogenesi.
Con tecniche FLIM-FRET con eccitazione a singolo fotone, utilizzando la coppia di fluorocromi
donore/accettore Alexa 488 (Cdo) e Alexa 568 (Cx43) si è dimostrata l’interazione diretta di queste
due proteine in cellule mioblastiche C2C12 in fase di differenziamento.
Utilizzando questa stessa coppia di fluorocromi abbiamo confermato l’interazione diretta fra fibrille
amiloidi di Sup35NM con il ganglioside GM1 (Alexa488 – GM1; Alexa568 – Sup35NM).
Abbiamo convogliato la radiazione di eccitazione di supercontinuo all’interno di singole cellule,
utilizzando fibre ottiche provviste di terminazioni di dimensioni nanometriche e movimentate con
un micromanipolatore.
Siamo riusciti a generare luce di supercontinuo nella zona blu/UV dello spettro scendendo fino a
300 nm con l’utilizzo di fibre ottiche microstrutturate non commerciali ed eccitando ordini di
propagazione superiori.

Esperimenti/Studi INO correlati:
Development of a combined Raman and multiphoton microscopy platform

Risultati scientifici:
1) Supercontinuum source tuned by an on-axis monochromator for fluorescence lifetime imaging
2) Dermal matrix scaffold engineered with adult mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma as a potential tool for tissue repair and regeneration
3) Microscopia confocale con luce bianca coerente
4) Toxic effects of amyloid fibrils on cell membranes: the importance of ganglioside GM1
5) Fiber optic nanoprobes for biological sensing
6) Neuronal rat cell imaging using a new UV-extended supercontinuum source