Esperimenti

Tracking di singola molecola in 2d e super-risoluzione in cellule viventi

L’obiettivo principale di questo esperimento è stato quello di utilizzare un approccio basato sul tracking di singola molecola (SPT) per affrontare le basi molecolari di patologie umane, in particolare il morbo di Alzheimer. La maggior parte delle ricerche in corso sui meccanismi molecolari del morbo di Alzheimer si basa su risultati medi. In questo caso, molti dettagli importanti possono essere persi e solo le caratteristiche più salienti sono considerate. Questo può spiegare almeno parte delle discrepanze derivanti dai diversi modelli che sono stati proposti nel corso degli ultimi anni. In questo contesto, esperimenti di tracking di singola molecola realizzati negli ultimi cinque anni hanno fornito una migliore comprensione della patogenesi del morbo di Alzheirmer monitorando le dinamiche delle singole specie oligomeriche citotossiche e la loro interazione con i componenti della membrana plasmatica. Nel complesso, la strategia sperimentale per SPT 2D di superficie si basa sul marcaggio immunochimico di specie bersaglio con anticorpi accoppiati a piccole (10-30 nm) sonde fluorescenti estremamente fotostabili chiamate “quantum dots” (QD). Registrazioni in tempo reale di singole molecole in movimento sulla membrana plasmatica di cellule viventi sono effettuate con una telecamera ad alta sensibilità. L’accurata localizzazione della particella fluorescente viene ottenuta fittando la sua point spread function con una funzione gaussiana. L’analisi delle traiettorie permette di calcolare lo spostamento quadratico medio e il coefficiente di diffusione di ogni particella. Questi parametri vengono utilizzati per adattare i dati a diversi modelli di diffusione, e per distinguere tra diversi tipi di movimenti (random walk, movimento limitato, movimento diretto, etc.). In particolare, combinando l’uso di anticorpi per specifiche conformazioni e tecniche SPT, abbiamo studiato la mobilità dei singoli oligomeri Aβ1-42 citotossici sulla membrana plasmatica delle cellule viventi. Tipologie strutturali distinte di oligomeri Aβ1-42 sono stati marcati con due diversi anticorpi conformazione-specifici. Mentre entrambi i tipi di oligomeri hanno mostrato un comportamento dinamico eterogeneo, la loro mobilità complessiva è risultata essere significativamente diversa. Al contrario, abbiamo scoperto che altri oligomeri amiloidi che condividono una conformazione simile, ma composti da peptidi diversi (Amilina e prione Sup35NM), mostrano comportamenti dinamici paragonabili a quelli trovati per oligomeri Aβ1-42. Questo studio fornisce la prova di un nesso tra la struttura quaternaria e la mobilità di membrana di proteine, rivelando che aggregati supramolecolari strutturalmente simili diffondono in modo simile nelle cellule. Inoltre, abbiamo dimostrato che oligomeri amiloidi formati da aggregati Aβ1-42 e amilina (un peptide associato con lo sviluppo di diabete di tipo II) interagiscono con GM1 e diminuiscono drasticamente la sua diffusione laterale sulla membrana plasmatica di cellule viventi di neuroblastoma. Il confinamento del GM1, un costituente delle zattere di membrana implicate nella neuroprotezione, causato dai due tipi di aggregati amiloidi può interferire con percorsi di segnalazione cellulare e contribuire alla perdita di neuroprotezione. In accordo con questi risultati, anche aggregati amiloidi formati dalla proteina prionica Sup35 risultano in grado di ridurre la mobilità di GM1.