Applicazioni di microscopia a scansione di conduttanza ionica (sicm) in citomeccanica
Nelle scienze della vita è di grande interesse comprendere come i sistemi biologici cambiano le loro proprietà strutturali, biofisiche e chimiche in risposta a esigenze funzionali. La risposta cellulare a stimoli meccanici è cruciale nello sviluppo embrionale come nella fisiologia adulta, ed è determinante in alcune patologie come l’arteriosclerosi, l’ipertensione, l’osteoporosi, la distrofia muscolare, le miopatie e il cancro.
Comunemente, per studiare le proprietà meccaniche locali di cellule si utilizza la microscopia a forza atomica (AFM). La risoluzione spaziale dell’AFM nell’imaging di cellule è di fatto limitata a circa 50 nm, perché la superficie cellulare, fragile e di forma corrugata e mutevole, viene parzialmente deformata dal contatto con la punta. Inoltre, la punta viene facilmente sporcata dalle macromolecole del glicocalice, degradando le sue prestazioni.
La microscopia a scansione di conduttanza ionica (SICM) è un tipo di microscopia a sonda che lavora in ambiente liquido (salino), in cui la punta non entra in contatto diretto con la superficie del campione. Questo è possibile perché si utilizza come punta una nanopipetta e come grandezza fisica che pilota il feedback la corrente ionica che scorre tra l’elettrodo inserito dentro la pipetta e l’elettrodo di riferimento che si trova nel bagno. Nel nostro lavoro “Measuring the elastic properties of living cells through the analysis of current–displacement curves in scanning ion conductance microscopy”, pubblicato in Pflugers Archive – European Journal of Physiology nel 2012, abbiamo dimostrato che la tecnica SICM è anche capace di misurare la risposta elastica locale di cellule vive in ambiente fisiologico, con risoluzione di pochi piconewton in forza e poche decine di nanometri in lunghezza [M. Pellegrino et al., Pflugers Arch – Eur J Physiol (2012) 464: 307–316.]. La misura viene realizzata applicando localmente uno stimolo meccanico al campione per mezzo della punta, soggetta ad una lieve sovrapressione. Diversi tipi di cellule sono stati studiati con il microscopio SICM [J. Rheinlaender et al., Soft Matter (2013) 9: 3230-3236].
L’esperimento ha l’obiettivo di misurare la distribuzione spaziale dei valori di elasticità in cellule vive in vitro usando un prototipo SICM sviluppato nel nostro laboratorio a questo scopo. L’attività si articola in due studi propedeutici e due argomenti di studio veri e propri.
1) sviluppo di una procedura per calibrare la forma e la dimensione della punta. La conoscenza della geometria della punta è necessaria per valutare la risoluzione spaziale del sistema, la pendenza massima del campione che può essere misurata e altri parametri sperimentali.
2) sviluppo di una procedura per calibrare la forza applicata alla superficie del campione in funzione della distanza sonda-campione. Infatti, poiché nel SICM non c’è contatto tra sonda e campione, è necessario ottimizzare la distanza di lavoro in modo che lo stimolo meccanico sia trasferito correttamente alla superficie del campione.
3) misure di valore locale del modulo elastico di cellule e correlazione con la rigidità del substrato. Le cellule adattano la loro rigidità a quella dell’ambiente in cui si sviluppano. La creazione di substrati di rigidità opportuna può essere usata per guidare la migrazione di cellule e la riparazione di danni tissutali.
4) Studio delle proprietà visco-elastiche di cellule. E’ stato osservato che, a parità di forza applicata, l’indentazione dipende dalla velocità del ciclo di carico. E’ quindi interessante studiare il modulo elastico in funzione della frequenza.
Misure di indentazione in alcune regioni di un fibroblasto NIH 3T3. Per i dettagli vedi ref. [1].
Immagine AFM della bocca di una pipetta con apertura di circa 150 nm (diametro)